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西安干細胞技術研究的發展歷程(下)

2021-12-29 16:45:46

      西安干細胞關于造血干細胞以外的干細胞研究起步相對晚,但發展極為迅速。早在1962年,Edwards首先發現兔囊胚中的胚胎干細胞( embryonic stem cells,ESC)的分化現象,認為囊胚中的ESC具有多向分化潛能,可自動分化為含有神經、骨、肌肉等多種細胞。由于ESC在體外的生長條件十分苛刻,細胞建系多年均未取得成功。早開展兩棲類、魚類ESC研究的是我國胚胎學創始人童第周,他于1930-1934年在比利時進行蛙受精卵研究中,發現受精卵中已經存在器官形成的物質,并觀察到內胚層和外胚層有多能性,吸附乳頭和感覺細胞的形成依賴于外源因素,卵質對個體發育起關鍵作用。隨后,童第周的研究小組將鯉魚的細胞核移植到去核的鯽魚受精卵內,發現重構的卵可以發育為成體并且具有鯉魚和鯽魚的些生物性狀,顯示細胞質對性狀形成有影響,于是他提出了通過核移植把兩種不能雜交的魚的優點結合起來并使之遺傳下去的設想。童第周是早提出體細胞核移植理論并在魚類實驗中取得成功的科學家,他是當之無愧的體細胞核移植之父,因為干細胞的許多研究進展得益于童第周的體細胞核移植成功的啟示及相關技術的發展。1997年,英國 Roslin研究所的Wilmut利用核移植技術將來自發育成熟的雌性芬蘭多塞特白面綿羊的成體乳腺細胞核移植入蘇格蘭黑面母山羊的去核卵母細胞中,經體外電脈沖使供、受體細胞融合然后將重構的融合細胞移植于另外一只蘇格蘭黑面母山羊的子宮內,該細胞在子宮內進一步分化和發育,后培育出世界頭克隆羊“Doly”。分子生物學分析證明, Dolly的遺傳物質來源于雌性芬蘭多塞特白面綿羊,其形狀與供細胞的白面山羊完全一致。從理論上講,Doly的遺傳物質可能含有少量來自卵母細胞的胞質中的線粒體,但從量上比較微乎其微,并不影響供者的主要遺傳特性。Doly.的誕生是生命科學領域里程碑式的重大技術突破,預示著大規模無性繁殖哺乳動物成為可能。之后,全球而掀起了利用體細胞核移植技術克隆動物的熱潮,并使其國際競爭白熱化。1998年,英國科學家利用體細胞核移植技術獲得轉基因克隆羊,2000年又獲得同源性基因重組后的克隆羊。中國科學家也先后利用體細胞核移植技術獲得克隆牛、山羊等,也在利用體細胞核移植技術將人皮膚成纖維細胞移植于兔卵母細胞中制備人源克隆胚胎方面取得成功。到目前為止,克隆牛、羊、鼠、兔、豬、猴等動物均獲得成功體細胞核移植技術日趨成熟,越來越多的技術人員利用該技術進行優良品系動物、基因修飾動物、遺傳性疾病動物模型培育及發育生物、基因功能研究。利用體細胞核移植技術克隆人類的研究因為存在嚴重的倫理問題,受到嚴格限制,但以疾病治療為目的治療性克隆在一些國家正在進行。治療性克隆技術路線與體細胞核移植技術克隆動物一致,只是完成體細胞核移植并在體外培育到囊胚階段為止,不能將胚胎移植到體內去繼續分化和發育成個體。治療性克隆的目的是從體外重構并在實驗室內培育岀的早期胚胎(囊胚)中獲得遺傳特性與供細胞者一致的胚胎干細胞,然后用于疾病洽療和相關研究。

       哺乳動物的胚胎干細胞體外建系,早于1981年獲得成功, Evans和 Kaufman等報道,將已經妊娠2.5天的小鼠卵巢切除,以改變孕鼠的激素水平,從而獲得延遲著床的囊胚,體外分離獲得內細胞群中的細胞,然后將其飼養于成纖維細胞飼養層上,在培養體系中加入抑制細胞分化的白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor,LF),體外傳代培養后建成小鼠ESC細胞系。將小鼠的ESC細胞系接種于同源小鼠皮下后可形成多種類型細胞組成的畸胎瘤,表明具有多向分化潛能。1984—-1988年間, Andrews等從睪丸畸胎瘤細胞系Tera-2中培育獲得具有多能性的胚胎癌細胞( embronic carcinoma cel),證明胚胎癌細胞在視黃酸的誘導下可分化為神經元樣細胞,同時還有一些其他類型的細胞。Pera等于1989年進一步證明,ESC可產生出3個胚層的組織。沿著小鼠ESC體外培養建系的技術路線和方法,美國 Wisconsin大學的 Thomas和 John Hopkins大學的 Gearhart于1998年幾乎同時報道,分別從臨床上體外受精后培育的囊胚內細胞群和妊娠5~9周的流產胎兒生殖脊中分離獲得人類胚胎干細胞和胚胎干細胞樣細胞并建立細胞系,這些細胞系表達胚胎干細胞的表型標志性分子,接種于免疫缺陷SCID鼠皮下后可長成包含血管、神經、肌肉、腺體、骨等功能細胞的畸胎瘤,證明人類ESC具有多向分化的潛能。人類ESC建系成功是人類胚胎發育和干細胞研究中的重大技術突破。體細胞核移植和人類ESC建系成功為干細胞技術的快速發展奠定了技術基礎,提供了研究模型,創建了干細胞的新來源。之后,以色列、澳大利亞、日本、新加坡、中國等也先后從IVF分離獲得人胚胎干細胞系,證明人胚胎干細胞在免疫缺陷鼠皮下可長出包含3個胚層組織的畸胎瘤,西安干細胞并在體外誘導胚胎干細胞生成神經細胞、造血細胞、肌肉細胞、胰島細胞等。2003年中國科學家陳系古、盛惠珍等人建立了人皮膚成纖維細胞與兔卵細胞融合的方法,為人類胚胎干細胞的研究開辟了新的途徑。 Massachusetts Advance Cell7 Technology于2004年報道克隆小鼠的干細胞可通過形成細小血管的心肌細胞修復心衰小鼠的心肌損傷,可以取代40%的癜痕組織和恢復心肌功能。

        美國科學家 Thompson實驗室的 Gurdon和日本京都大學 Yamanaka實驗室于2007年幾乎同時報道,利用病毒載體轉基因技術將Oc3/4、Sox2、c-Myc和Kif等轉錄因子基因導入皮膚成纖維細胞,可誘導其轉化為幾乎與胚胎干細胞完全一樣的多能干細胞,這種細胞在生長形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸胎瘤生成能力、分化潛能等均與胚胎干細胞極為相似,被命名為誘導性干細胞( induced pluripotent stem cell,iPS細胞)iPS技術的杰出貢獻是創建了多能干細胞的新來源,使多能干細胞的獲取更容易,方法更簡便,可以實現個性化治療,避免了免疫排斥和獲取胚胎干細胞的倫理問題,使胚胎干細胞類細胞的應用向臨床推進了一大步。如果說人類胚胎干細胞系的建立是干細胞研究的。

        重大里程碑的話,iPS技術就是一個革命性的技術革新, Gurdon和 Yamanaka因此于2012年獲諾貝爾生理學或醫學獎。中國科學家周琪等于2009年在Nae雜志發表文章,報道了利用iPS細胞囊胚注射獲得具有繁殖能力的小鼠,證明iPS細胞具有全能性。我國科學家鄧宏魁等于2013年在 Science雜志上報道,利用小分子化合物組合成功誘導體細胞重編程并獲得誘導性多能干細胞,證明該誘導細胞可以重新分化為各種組織器官類型的功能細胞,將其命名為化學誘導的多潛能干細胞(CiPS細胞),該研究開辟了一條全新的體細胞重編程途徑。CiPS細胞技術不涉及使用病毒載體和引入基因,可以說是多能干細胞研究的又一重大技術突破,使多能干細胞的獲取更容易、更安全。

        既然可以人為將成熟體細胞的發育時鐘撥回“零點”,西安干細胞重新啟動發育過程并發育為完整個體,而從早期胚胎獲得的干細胞可以在體外被誘導分化為各種類型的成熟細胞,那么,成體組織是否也存在干細胞呢?回答是肯定的。傳統認為,只有某些成體組織中存在干細胞,例如骨髓,但它們只能向所在組織或特定類型的成熟細胞分化,難以打破胚層限制,分化為其他類型的成熟細胞。1999年以來,多個研究小組證實,來自成年動物和人的骨髓、肌肉、中樞神經系統、皮膚、肝、腎、肺、臍帶血、臍帶、脂肪、胎盤等組織中均有干細胞存在,到目前為止,幾乎在成體所有組織中找到了干細胞,證明成人體內的干細胞存在于組織中的特定區域,數量十分稀少,處于休眠狀態,組織受損時可被激活,開始分裂。骨髓組織中的干細胞含量為豐富,被認為是成體的干細胞庫,其中含有造血干細胞、間充質干細胞血管干細胞等,還有人從骨髓組織中分離獲得胚胎干細胞樣細胞。在正常情況下,骨髓組織中的造血干細胞僅占有核細胞的0.1%~0.5%,其中95%處于G0期,分裂方式為不對稱分裂,分化后的數量和特性不變。從理論上講,骨髓造血干細胞的數量是保持不變的,但可能由于病理因素的影響而減少。骨髓造血干細胞具有異質性,在形態和生物物理特征及表面標志上具有“多態性”和“等級性”。目前認為造血干細胞主要表達CD34抗原,常以CD34、Thy(CD90),低表達或不表達CD38和HLA-DR及缺乏譜系抗原(Lin)為判定標準,一旦分化為各系原、幼細胞后,CD34抗原消失。骨髓間充質干細胞占單核細胞總數的0.001%-0.01%,并隨年齡的增加而減少,出生時骨髓間充質干細胞的比例占有核細胞的萬分之一,10歲、30歲、50歲、80歲人群的骨髓間充質干細胞的比例分別為1/10萬、125萬、1/40萬、1/200萬。 Goode等于1999年發現小鼠肌肉干細胞可以橫向分化為血液細胞,這一發現后來被多項實驗研究證實,其他組織來源的干細胞也同樣具有橫向分化功能。對性別錯配的肝、腎移植者進行回顧性分析研究發現,移植后的肝、腎組織中有一定數量的受者細胞在組織內分布并分化為肝、腎細胞,推測這類細胞可能是來源于骨髓的干細胞。給全身或局部損傷動物注射干細胞動員劑,骨髓干細胞可進入損傷組織并參與損傷修復。在1999-2000年間,先后有人將來源于骨髓的干細胞移植到腦組織中,發現骨髓干細胞在腦神經組織中轉化為神經細胞,同時又將來源于神經組織的干細胞移植到骨髓之中,發現神經干細胞同樣可在骨髓中分化、發育成血液細胞。這兩個實驗結果初步表明,成體組織中的干細胞(組織或成體干細胞)具有跨系、甚至跨胚層分化的能力。后來的一些研究報道證明,成體干細胞的確具有多向分化潛能,可以跨胚層分化為多種類型的功能細胞,西安干細胞到底向什么方向分化,決定于其所處的組織微環境和分化調控因子。西安干細胞已經證實,骨髓干細胞可橫向化成為血液、骨、軟骨、成骨、肌肉、神經、肝臟、胰腺、脂肪等多種細胞類型。

西安干細胞

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