在UCMSC的研究與應用領域，免疫細胞存儲如何高效獲取足夠數量的 UCMSC并保持其生長活力和功能是人們關注的關鍵技術問題之一。目前從人臍組織中分離提取 UCMSC主要有酶消化法和組織塊貼壁培養法，其中酶消化法有單酶消化(膠原酶、Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶)雙酶消化(膠原酶聯合胰酶)三酶消化(膠原酶聯合透明質酸酶)法等，也有五聯消化法的報道(Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原、透明質酸酶、胰酶、 DNAase)。研究者認為多酶聯合消化可以提高帶間充質干細胞的獲得率和縮短酶消化時間，減少酶消化對細胞活性的影響。隨著技術方法的不斷改進，人臍帶間充質干細胞的獲得率已經從1×104細胞/cm提高到了1×105細胞/cm，效率提高了上百倍，但與組織中臍帶間充質干細胞的實際含量和理論值差距甚遠，在分離制備時間和數量上還有較大的提升空間。傳統制備方法存在的主要問題是：①臍帶間充質干細胞存在于臍帶的黏膜組織中，組織中含有膠原、透明質酸、黏多糖、結締組織、基質細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞等。華爾通膠由膠原纖維骨架和存在于其間的蛋白多糖組成，其中含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ四種膠原纖維分布，而Ⅳ型膠原占70%以上。蛋白多糖中含量較高的是透明質酸，含量也在70%左右。臍帶組織中含有多種細胞外成分，傳統的酶消化難以充分消化臍帶間充質干細胞周圍的連接成分，不利于間充質干細胞游離，材料浪費較大。②酶消化法缺乏統一的標準，提髙消化酶的含量或延長消化時間可能對細胞造成損傷，對細胞生長活性有較大影響。③酶消化后會有大量的死細胞細胞碎片和酶解物，免疫細胞存儲這些成分會導致間充質干細胞貼壁和生長緩慢，影響細胞周期。④酶消化會破壞間充質干細胞的表面分子影響間充質干細胞接受周圍信息及信號轉導，從而影響細胞生長和“干性”維持。因此，針對臍帶組織成分，采取多酶聯合消化法，優化酶消化組合和消化方法，充分釋放間充質干細胞，是值得進一步研究的關鍵技術之一。組織塊貼壁培養法主要是利用間充質干細胞的貼壁生長特性使其從組成中自然爬出并沿組織周圍延伸生長，該方法避免了酶消化對細胞的損傷，但該方法需要對組織進行機械分散處理，容易導致細胞死亡和出現大量組織或細胞碎片，導致培養系統的黏稠度增加，不利于細胞生長，同時由于間充質干細胞需要從組織中自然延伸生長，只有分布在組織邊緣的細胞容易生長，而處于組織深部的細胞則難以暴露和游離生長。組織塊貼壁培養法的關鍵是首先要盡可能將組織分離成小塊，一般應在1mm3以下。其次是通過自然沉降或離心洗滌法去除雜質，排除死細胞、細胞碎片及游離組織成分對組織塊貼壁和細胞生長的影響。令組織塊充分貼壁是間充質干細胞生長的先決條件，應設法使組織塊能夠均勻分布于培養瓶底和充分貼壁，主要措施是在接種初期只加少量培養液，讓全部組織塊有接觸瓶壁的機會，待其貼壁牢固后在補加新培養液。減輕組織分散強度，減少機械損傷，提髙細胞的游離空間，增加貼壁空間和面積是提高臍帶組織利用率和間充質干細胞獲得率的重要措施。組織反復培養法是本實驗室長期摸索后建立起來的臍帶間充質干細胞高效培養技術，在優化組織塊制備和培養體系的基礎上，免疫細胞存儲通過組織反復貼壁培養法，大大提高了臍帶組織的利用率和原代間充質干細胞的獲得率，每個組織塊可反復培養3次以上，與單次培養相比，可提高原代間充質干細胞的獲得量3倍以上。

臍帶間充質干細胞在體外傳代擴增體系中增殖速度比原代快，一般6天左右即可達到85%90%融合，在本實驗室連續傳代培養 UCMSC，至少在8代以內并未顯著降低其活性，如果在培養細胞中添加“干性”維持因子和促生長因子等可繼續傳代而維持其活性。目前，臍帶間充質干細胞體外擴增中比較穩定的方法仍然是貼壁傳代培養法，實際上采用該方法已經完全可以滿足“一條臍帶，一個工廠”的技術需要，因為結合低溫凍存技術，一條臍帶可制備出滿足數萬人臨床治療需要的標準化細胞產品。采用細胞工廠(多層培養瓶)可顯著提高擴增效率，其原因是大大增加了細胞的生長面積，可一次性擴增獲得大量的細胞，但這種方法增加了消化收集細胞和動態觀察的難度，需要由技術比較熟練和經驗豐富的技術人員實施。臍帶間充質干細胞在體外傳代擴增是其產業發展和臨床硏究的關鍵技術問題，因為沒有足夠數量的標準化間充質干細胞產品，產業化和臨床應用就無從談起。為此，免疫細胞存儲人們對間充質干細胞體外擴增技術進行了大量研究，開發出一些能夠顯著提高擴增效率的新技術，其中包括增加細胞貼壁面積的培養技術，例如微載體培養技術、中空纖維培養體系、懸浮培養技術、多空生物材料培養技術等，隨著這些技術的發展，間充質干細胞的體外擴增效率還將進一步提高，臍帶間充質干細胞將成為標準化、工廠化生產的真正意義上的特殊“新藥”。優化體外分離培養和擴增體系是未來間充質干細胞體外制備技術發展的重要方向，其中包括基礎培養基的成分優化和“干性”、促生長因子組合篩選以及新型因子的發現與應用等。培養體系中的動物血清有攜帶有攜帶病原生物的風險，特別是一些未知的對人和動物均有感染力的病原，以及現有技術和排除要求難以覆蓋的病原等。在臍帶間充質干細胞的質量控制標準中，關于病原檢測的種類目前尚缺乏統一要求，主要參考輸血檢測要求進行幾種常見病原檢測，難以做到排除所有病原。另外，殘留血清中的異源蛋白是重要的過敏原可能對臨床應用帶來威脅。因此，尋找和利用非動物來源血清及替代物也是未來間充質干細胞制備技術發展的重要方面，一些新型無血清培養基也正在開發利用中。常見的胎牛血清替代物有人臍帶血血清、血小板裂解物、蛋白水解產物、細胞因子等。免疫細胞存儲目前存在的問題是間充質干細胞在添加人源血清和血清替代物的培養系統中生長活力相對低且成本較高，研發高效無血清培養技術仍然是所有細胞治療技術發展必須解決的問題。