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密度梯度法是在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續分布的密度階層，是一種區帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13~1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，免疫細胞存儲但步驟煩瑣，耗時，對離心時間極為敏感。和超高速離心一樣，密度梯度法所有步驟都要在4℃完成。具體操作步驟如下：
1.按照前述超高速離心法步驟獲得初步純化的外泌體沉淀。
2.用25mPBS重懸外泌體沉淀。
3.制作墊子小心加入4 maTris/sucrose/2O溶液到SW28管底部。免疫細胞存儲
4.小心加入外泌體懸液到已經鋪有墊子的SW28管液體表面，注意不要破壞墊子表面。1000009g,4℃,離心75分鐘。
5.用5m填充有18-G針的注射器，沿著離心管壁深入墊子，收集3.5ml包含外泌體的Tris/ sucrose/2O溶液。
6.將上述35ml溶液轉移到新的離心管中，加入60mPBS洗滌。采用45轉頭,10000×g，4℃，離心70分鐘，去上清，保留沉淀
7.用50~100μuPBS重懸沉淀，免疫細胞存儲所得沉淀即為與超速離心法相比純度更高的外泌體。
