聚乙二醇(PEG)為常用的多聚物,可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀,早先應用于從血清等樣本中收集病毒,現在也被用來沉淀外泌體,其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題:比如純度和回收率低,雜蛋白較多(假陽性)顆粒大小不均一,產生難以去除的聚合物,造血干細胞存儲機械力或者 Tween-20等化學添加物將會破壞外泌體等,影響實驗結果。
此處以某公司的產品為例,對其操作流程進行一個簡單介紹:
實驗前準備:由于FBS中含有豐富的外泌體,這將會給后續實驗帶來很大的污染,因此用48小時饑餓后的培養基上清,玻璃管,4℃,離心機,0.22um一次性濾器。
注意:饑餓細胞前要保證細胞狀態良好,細胞狀態直接關系到外泌體的產量。
1.收集4ml細胞培養上清。
2.3000×g,15分鐘4℃離心或者0.22μm濾器過濾。
3.配制反應混合液(A:0.25ml;B:0.25ml;C:lml),造血干細胞存儲按照ABC的順序加,將混合物劇烈震蕩10秒后立即加入上一步準備的培養基上清中;注:使用玻璃管而不是塑料管。
4.劇烈震蕩30秒之后冰上靜置30分鐘。
5.分層后快速去除頂層和底層,將云霧狀層立刻轉移到1.5mlEP管中,離心5000×g3分鐘;其中頂層保留作為實驗對照。
6.再次分層后去除頂層和底層,將云霧狀層立刻轉移到05m的EP管中,離心5000×g3分鐘。
7.再次去除頂層和底層,開蓋揮發10分鐘;但不要讓沉淀完全干燥。
8.加入4倍沉淀體積的1×PBS,造血干細胞存儲用槍尖上下混勻40-60次后放在水平震蕩儀上高速震蕩10分鐘,間隔3分鐘上下吹吸40次(這一步非常關鍵,外泌體可能被包裹在沉淀中難以重懸,造成結果的產量低)。
9.5000×g,5分鐘離心,上清過柱,沉淀4℃保留。
10.1000×g,10分鐘,收集過柱后的液體即為產物。