色譜法

色譜法是利用根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關系而對溶質進行分離的分析的方法。樣品中大分子不能進入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被流動相洗脫出來；小分子可進入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫出。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設備，應用不廣泛。目前，根據此原理也有一些商品化的試劑盒出現，代表性產品為Lzon公司開發的qEⅤ柱。其優勢在于分離時間僅為15分鐘，西安干細胞公司所需要的樣本量少，極大程度降低蛋白復合物產生和囊泡聚集的風險，不會破壞外泌體的生物學活性和結構，因此有越來越多的研究者采用該方法分離外泌體。

其操作流程如下:

1.安全預防

(1)當使用qEV柱時采取適當的個人防護措施，比如實驗服，手套和防護鏡。

(2)柱子的抗菌溶液包含0.05%w/v的疊氮化鈉。大量的疊氮化鈉有毒，所以應該避免皮膚和眼睛的直接接觸。

(3)廢棄緩沖液應妥善處理：疊氮化鈉會在銅制管道中累積引起爆炸。生物樣品可能有危險，當使用qEV柱時，請教實驗室安全員有關樣品安全操作的要點。

2.保存柱子保存在含有抑菌劑，例如20%乙醇，或<0.05%w/v的疊氮化鈉)的溶液中，存放于4-8℃。抑菌劑可以在沖洗步驟時引入。使用前將柱子固定，使液面水平，確保柱子垂直，不要移除底部滑動蓋，西安干細胞公司小心緩慢地移去頂蓋。

3.平衡柱子

(1)移除底部滑動蓋，并且使用至少10m洗脫緩沖液(PBS)沖洗柱子。如果不是使用PBS洗脫，那么至少使用30m洗脫緩沖液沖洗柱子。記下5ml緩沖液通過尺寸排阻柱通過的時間，這可用于判斷何時需要清洗柱子。

(2)確認有充分的平衡時間使柱子溫度介于操作溫度范圍內。

(3)不要使柱子變干。頂部的篩板必須保持濕潤。柱子變干會影響其功能。

(4)使用當天新配的過濾(02um)緩沖液避免引入顆粒物污染。

     4.樣品的純化

(1)在柱子移除底部滑動蓋之前，用移液槍移除篩板頂部的緩沖液。

(2)加入500樣品。

(3)立即移去底部滑動蓋。

(4)立即開始收集0.5ml餾分；開始的六個餾分(3.0ml)是空隙體積，不包含囊泡，通常無需分析。建議將空隙體積收集在同一個收集管中來節約時間，并可避免6個單獨的管子帶來的測量誤差。

(5)當樣品剛剛進入柱子頂部篩板(與之相平)，加入更多的緩沖液，西安干細胞公司但是不要高于頂部篩板2ml。等待直到后一滴樣品剛剛進入柱子頂部篩板，避免樣品稀釋。

(6)空隙體積之后立即收集3個囊泡餾分，每個餾分500u(餾分7、8和9)。測量每個餾分的EV濃度(使用 Izonq Nano)和蛋白純度。為了得到高濃度囊泡，使用高EV濃度的餾分(通常7和8)。注意：合并餾分會稀釋EV濃度。為了得到高純度囊泡，使用低蛋白濃度的餾分。

(7)當收集完囊泡餾分之后，用至少10m緩沖液沖洗柱子，并按照要求保存柱子。記下5ml緩沖液通過排阻柱所需要的時間，這對于檢測何時清洗柱子很有用。流速的改變可能暗示柱子被堵住或被污染。