1.在無菌條件下取臍帶一根，轉移入50ml離心管中加入生理鹽水反復沖洗3遍以上，最后用雙抗水浸泡5~10分鐘，用生理鹽水沖洗干凈后，在無菌的培養皿中，用鑷子配合剪刀去除被膜、血管等，再用生理鹽水沖洗去除血液和雜質。如果是制備臨床應用細胞，必須是取自檢査合格的臍帶，最低檢測標準至少應符合臨床輸血要求，HV、HBV、HCV、梅毒、CMV檢測為陰性的健康產婦。

2.用高壓滅菌過的眼科虹膜剪將組織分離為0.5cm長的組織塊若干，造血干細胞存儲再將組織塊轉移至一個1.5mlEP管內，用虹膜剪將EP管內的組織剪碎至糊狀，一般使組織塊在1mm3以下。

3.加入等量DMEM/F12基礎培養基，直接將EP管內的糊狀組織接種于培養瓶中一個EP管對應一個T175的培養瓶，然后加入10ml已調整好pH值的含10%FBS的完全DMEM-F2培養液，輕輕晃動培養瓶使組織塊均勻分散于培養瓶底部，然后放入5%CO237℃、飽和濕度的培養箱中靜置于貼壁培養，期間避免振蕩，目的是使富含間充質干細胞的組織充分貼壁。

4.靜置培養24小時后，在倒置顯微鏡下觀察，組織塊貼壁牢固后，可補加完全培養基10~15m之后3-4天換1次培養液，靜置培養7~9天后，可見大量細胞貼壁。此時，用吸管

輕輕吸出一半培養液，輕輕搖晃培養瓶，使組織塊脫離瓶底，吸棄上清和懸浮組織塊并接種于新培養瓶中加入新鮮10%FBS的完全 DMEM/F12培養液繼續進行貼壁培養，密切觀察細胞生長情況，依據細胞生長情況每隔3~4天換液1次。

5.第1次貼壁培養成功并更換培養液時，可用吸管反復吹打，使微組織快脫落，再將脫落下來的組織塊接種至相冋面積的另一塑料培養瓶的瓶底進行貼壁培養。造血干細胞存儲同一臍帶組織塊至少可反復進行3次重復貼壁培養，即可獲得常規培養3倍數量以上的原代UCMSO。

6.臍帶組織塊培養后2周左右，細胞可長滿瓶底，達到80%以上融合，此時可用吸除培養基，加入適量0.25%的胰酶，充分搖晃均勻，置于37℃培養箱中放置5分鐘，注意觀察細胞形態變化，發現細胞收縮，搖晃培養瓶有片狀細胞脫落時，立即加入含10%血清的培養液10~-15m終止反應，用吸管吹打使細胞完全脫落，然后將細胞懸液移入離心管中300~400×g離心10分鐘，再加入生理鹽水10m，離心洗滌，反復3次后，計數活細胞，用完全培養基稀釋，收集細胞進行凍存或繼續傳代培養。傳代培養的過程是純化間充質干細胞的過程。

7.傳代培養通常采用專用細胞培養瓶，以 DMEM/F12培養基為基礎，按原代培養密度1:3的比例進行傳代培養。作者所在實驗室創建了一種以臍帶組織塊培養法為基礎的高效、大規模體外制備技術，組織塊可反復接種培養3次以上，獲得原代細胞的數量在1×10個細胞以上，傳代培養至第3代，可獲得36×100個細胞。

8.長期在體外傳代培養的是否會衰老、突變等一直是人們關注的問題，也是影響細胞質量的深層次問題。國外對骨髓間充質干細胞體外長期培養研究發現：如果在體外連續傳代培養60次以后就會觀察到間充質干細胞衰老和自動向脂肪細胞分化。筆者長期培養實驗證明：在體外傳代培養8次以內的臍帶間充質干細胞安全性和活性是有保證的。連續傳代8次以后，個別細胞會發生染色體變異。

除了上述組織貼塊法分離培養臍帶間充質干細胞之外，還可以采用膠原酶、造血干細胞存儲胰酶混合消化法制備臍帶間充質干細胞：膠原酶消化法是組織塊貼壁法的延伸方法，起初步驟與組織塊貼壁法相同，只是臍帶剪成1mm3大小的組織塊后將組織塊轉入1g/L的膠原酶Ⅳ中,37℃孵育攪拌消化30分鐘后，隨即用1g的胰酶消化30分鐘，再用完全培養基終止消化，經200目篩網過濾消化液，離心棄上清，生理鹽水洗滌2次，調整細胞接種密度為1×105個/ml接種到含 DMEMF2培養基的T175塑料培養瓶中,5%C0237℃靜置培養48小時后換液，除去未貼壁的細胞，原代呈梭形、纖維樣細胞,3-4天細胞可克隆樣生長,5-6天后細胞傳代逐漸融合達70%-80%時呈勻質、渦旋狀排列生長。

酶消化法和組織貼塊法是分離培養 UCMSC兩種基本方法，但酶消化法存在酶的濃度和消化時間控制不好就可能會損傷細胞膜、降低細胞活性甚至改變細胞功能，而且操作煩瑣，這不符合組織培養的基本原則，因為操作越煩瑣，污染的機會就越多，細胞突變的概率也越大。從簡單、方便的組織培養原則出發，組織貼塊法優點更多：①方法簡單：直接剪碎臍帶為糊狀直接培養，操作步驟少，大大縮短了實驗室處理的時間，而且分離方法容易標準化；②經濟實用：分離培養 UCMSC的過程中不使用膠原酶，分離成本低；③安全性好：與所有干細胞一樣，如何防范 UCMSC在分離培養過程中的污染和變異一直是人們關注的一個重點怎樣才能最大限度地降低干細胞污染和變異的風險呢?盡量減少對干細胞的干預處理就是

最大限度地降低干細胞污染和變異的根本方法，比如簡化體外分離操作環節，就可大大降低污染的概率，比如減少各種“外來物質”的接觸，這也是《人的體細胞治療申報臨床試驗指導原則》的基本要求—盡量避免異體血清、細胞因子、抗生素等“外來物質”的使用，當然酶消化法中常用的各種酶也屬于“外來物質”的范疇，減少這些“外來物質”的使用和接觸，既可降低細胞變異的概率，又可有效防止各種病原微生物的傳播。