1.原理試劑盒用—對 EDB 病毒(EBV)特異性引物和一條 EB 病毒(EBV)特異性熒光探針,配以 PCR 反應液、耐熱 DNA 聚合酶(Taq 酶),核苷酸單體(dNTPs)等成分,用 PCR體外擴增檢測 EB 病毒(EBV)DNA。

2.性能參數最低檢出限濃度 5 ×10°基因拷貝 /ml,線性范圍 5×10°~5×10°基因拷貝/ml。

3.標本要求

(1）標本類型:臍帶間充質干細胞懸液。

(2)標本保存和運輸:標本可立即用于測試,也可以保存于-20℃待檢,保存期為6個月,標本運送采用0℃冰盒。

4.所需設備 ViiA7 DX 型核酸擴增熒光檢測儀、造血干細胞存儲混勻器、冰箱、生物安全柜、紫外燈。

5.試劑 DNA 提取液( 500μ/ 管)、PCR 反應管、陰性質控品(150μl/管)1 管、臨界陽性質控品（200μ/ 管）、強陽性質控品(200μl/管)、EBV 陽性定量標準品(1×10*-1×10°基因拷貝/ml, 10μl/ 管)4 管。

6.程序步驟

（1）DNA 提取：陰性質控品處理：

1）取出陰性質控品,8000rpm 離心數秒,吸 50μl 至 0.5ml 滅菌離心管中,加入 50μDNA提取液充分混勻,100℃恒溫處理(10±1)分鐘。

2）12 000mpm 離心 5 分鐘,備用。

（2）標本處理：

1)取全血 1ml 至干燥玻璃管試管中,加入生理鹽水 1ml 輕搖混勻。

2）取干燥玻璃管試管加入 500μl淋巴細胞分離液。

3）將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細胞分離液的試管中(注意沿著管壁,速度要慢）。

4）2000mpm 離心 20 分鐘(建議用水平離心機)。

5）吸取白細胞層(從上往下的第二層),加入 1.5ml 離心管,12 000rpm 離心 5 分鐘。

6)棄上清,沉淀中加入 50μDNA 提取液充分混勻,100℃恒溫處理(10±1)分鐘。

7) 12 000rpm 離心 5 分鐘,備用。

（3）EBV 臨界陽性質控品處理(同陰性質控品）。

(4）EBV 強陽性質控品處理(同陰性質控品）。

(5） EBV 陽性定量參考品處理:8000rpm 離心數秒,備用。

（6）PCR 擴增：

1)加樣:①單管單人份:取 PCR 反應管若干,造血干細胞存儲加入處理后的樣品(標本,陰性質控品、臨界或強陽性質控品)上清液2u或陽性定量參考品2ul,8000pm離心數秒，放入儀器樣品槽。②大包裝：按比例( EBV PCR反應液40人份)取相應量的PCR反應液及Taq酶，充分混勻后按43u/管分裝至02ml離心管中，備用。向準備好試劑的02ml離心管中，分別加人處理后的樣品(標本、陰性質控品、臨界或強陽性質控品)上清液2μ或陽性定量參考品2μul,800opm離心數秒，放入儀器樣品槽。

2)編輯：①按對應順序設置陰性質控品，陽性定量參考品及未知標本(含臨界、強陽性質控品)，并在Name欄中設置樣品名稱。選中所有設置樣品孔，點擊工具欄P鍵，選擇 PRI Primer后關閉窗口。選擇工具欄中Q鍵，輸入對應陽性定量參考品濃度。②打開 Instrument窗口設置循環條件:93℃2分鐘,93℃45秒→55℃60秒→10個循環,93℃30秒→55℃45秒→30個循環。保存文件，運行。

3)結果分析：①反應結束后保存檢測數據文件。②分析條件設置：根據分析后圖像調節 Basement的stat值、stop值以及 Threshold的 Value值(可根據試劑情況自行調整，start值可以在1~10、stop值可以在5~20、 Value值可以在0.01~0.2范圍選擇)，使 Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即 correlation數值介于-1.0~-0.97，在 Analisis菜單下選擇Analyze自動分析結果。③到Tray窗口，記錄未知標本數值。④記錄 Calculated concentration下面一起自動分析計算出的未知標本數值(C)。

7.質量控制

(1)陰性質控品：增長的曲線不呈S形曲線或CT值=30。

(2)陽性質控品：增長曲線呈S形曲線，且強陽性質控品定量參考值在6.310×10~1.000×103基因拷貝/ml范圍，臨界陽性質控品定量參考值在6.310×103~1.000×103基因拷貝/ml范圍。

(3)陽性定量參考品，增長曲線呈S形，CT值<27。

以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新檢測。

8.結果判定

(1)陰性結果判定：如果增長曲線不呈S形曲線或CT值=30，造血干細胞存儲則實驗結果判為樣品的EBV DNA含量小于檢測極限。如有擴增曲線，建議2個月以后復查。

(2)陽性結果判定：如果增長曲線呈S形曲線且CT值<30，則實驗結果按以下方法判斷：①若樣品的C<500E+003，則全血樣品 EBV DNA總含量<5.0×103基因拷貝/m；②若樣品的500E+003≤C≤500E+007，則全血樣品 EBV DNA總含量=C基因拷貝/ml；③若樣品的C>500E+007，則全血樣品 EBV DNA總含量>5.0×10基因拷貝/ml。

9.支持性文件《廣州達安EB病毒熒光定量檢測試劑盒說明書》《 ABI ViL7熒光定量PCR儀標準操作及維護程序》。