1.原理本品選取人巨細胞病毒株(即人皰疹病毒5型)-AD169基因組中編碼即刻早期轉錄調節蛋白的E1基因的一高度保守的非編碼區為擴增靶區域，設計特異性引物及熒光探針，擴增片段長度為86bp，利用實時熒光定量PCR技術，定量檢測尿液、乳汁、血清或淋巴細胞樣本中人巨細胞病毒DNA。

2.性能參數最低檢出限濃度為10 copies/ml。

3.標本要求

(1)標本類型：細胞培養上清液。

(2)標本儲存和運輸：室溫放置不超過8小時,48℃不超過72小時，造血干細胞存儲-20℃保存期6個月，應避免反復凍融。室溫運輸。

4.所需設備 ABI PRISM7000熒光定量PCR儀、臺式高速離心機、混勻器、冰箱(4℃、-20℃)生物安全柜、紫外燈。

5.試劑DNA提取液(500管)2管、CMV-PCR反應管20管、陽性定量參考品(2osol)(50u/管)1管、弱陽性質控品(200管)1管、強陽性質控品(200uy管)1管、陰性質控品(50/管)1管、稀釋液(500/管)1管。

6.程序步驟

(1)樣本制備(在樣本制備區操作)

1)血清處理：吸取上清(注意勿細胞)至無菌1.5 ml append管，即為血清標本。取50血清加50uDNA提取液打勻,100℃保溫10分鐘,1200pm離心5分鐘，取上清液(含病毒DNA)5μ做PCR擴增。

2)陰陽質控品處理：質控品加50uDNA提取液打勻。100℃保溫10分鐘(誤差不超過1分鐘),2000pm離心5分鐘，取上清液5μl做PCR擴增。

3)參考品稀釋和處理：將陽性定量參考品(2×10 copies/ml)600m0n離心數秒標示為10另取4支滅菌新05ml離心管，分別加入90u稀釋液，依次標示為107-10。吸取10管1ou至10管，用加樣器反復混勻后換新吸頭取10ou至10管，依此方法依次稀釋至10管。-20℃保存；吸取5個(2×103-2×10 copies/ml)的陽性定量參考品梯度和陰性質控品各40ul，分別加40μDNA提取液打勻，以下步驟同樣本處理。造血干細胞存儲上清液(含病毒DNA)待用于PCR擴增。

(2)PCR擴增(在擴增區操作)：取CMV-PCR反應管若干，分別加入處理后上清液(含病毒DNA)各5μ,6000m離心1分鐘。將各反應管放入定量PCR儀器的孔樣品槽內，按對應順序設置陰性質控品、陽性定量質控參考品梯度(應設置為10-10 copies/m1)以及未知標本，并設置樣品名稱標記熒光基團種類和循環條件:93℃→2分鐘預變性，然后按93℃45秒→5℃60秒，先做10個循環，最后按93℃30秒→55℃45秒，做30個循環。

(3)結果分析：反應結束后保存檢測數據文件。根據分析后圖像調節Baseline的stat值(2~4)，stop值(7-9)以及 Threshold值，使 Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳( correlation數值介于-0.97~-1之間， correlation數值等同于r值，最后到 Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標本數值(Qty)。

(4)質量控制:

1)陰性質控品:全部陰性。

2)陽性定量參考品：全部陽性lr≥0.97( correlation數值等同于r值)。

3)弱陽性質控品數值范圍:2.5×104-4×10°拷貝/ml。

4)強陽性質控品數值范圍:25×10-4.×107拷貝/ml。

以上要求需在同一次試驗中同時滿足。否則，本次試驗無效，造血干細胞存儲全部試驗應重新進行。

(5)結果判斷:

1)陰性結果判定：如果增長曲線不是典型的S形曲線或CT值=30，則實驗結果判為小于10copies/ml。

2)陽性結果判定與計算：如果增長曲線呈典型的S形曲線且CT值<27，則實驗結果判為陽性。樣品的 HCMV DNA含量( copies/ml)=Qy/20。若樣品為血清，則樣品中的CMVDNA含量( copies/ml)=Qty。

7.支持性文件《人巨細胞病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒說明書》 ABI PRISM7000熒光定量PCR檢測儀操作程序》。