獲得了質(zhì)量合格的 UCMSC后，如何保存 UCMSC是個(gè)十分重要的大問(wèn)題，因?yàn)榕R時(shí)制備 UCMSC不能及時(shí)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)研究的需要，更重要的是不能確保細(xì)胞質(zhì)量，尤其是為了制備臨床應(yīng)用級(jí)別的 UCMSC時(shí)，只有建立規(guī)模化、規(guī)范化的 UCMSC凍存和復(fù)蘇技術(shù)體系，才能適應(yīng) UCMSC的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展要求。

一、UCMSC的凍存

用凍存液將細(xì)胞稀釋成5×10細(xì)胞ml的密度，分裝于凍存管后漸進(jìn)降溫，臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)zui終于-196℃的液氮中長(zhǎng)期凍存。凍存液需要在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加保護(hù)劑，以確保滲透性冷凍保護(hù)劑可在細(xì)胞懸液凍結(jié)凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，維持凍存過(guò)程中的細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡，保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，使細(xì)胞內(nèi)的水分不會(huì)過(guò)分外滲，從而使細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓基本一致。如果凍存臨床應(yīng)用級(jí)別的 UCMSC，則必須使用臨床應(yīng)用的消化液及凍存液才能確保臨床應(yīng)用安全。

凍存液的配制及選擇

1.基礎(chǔ)溶媒 UCMSC凍存液的配制過(guò)程中用到的基礎(chǔ)溶媒介質(zhì)主要為細(xì)胞培養(yǎng)液，使用這些介質(zhì)的主要作用是作為細(xì)胞懸浮劑和輸注的載體，如果是制備臨床應(yīng)用級(jí)別的UCMSC則需要使用臨床上的常用藥品。

(1)常用細(xì)胞培養(yǎng)液：如含10%血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液。

(2)生理鹽水：生理鹽水中鈉離子54mmo/L、氯離子154mmoL、pH50左右偏酸性、滲透壓308 mOsmol/L，主要活性成分為氯化鈉，而且其中不含任何營(yíng)養(yǎng)成分。細(xì)胞懸浮于生理鹽水中可能因缺乏營(yíng)養(yǎng)易發(fā)生死亡聚集，從而減少有效細(xì)胞數(shù)量，并且聚集成團(tuán)的細(xì)胞在回注時(shí)也會(huì)堵塞輸血器及微血管，給臨床上的使用帶來(lái)不安全的因素。

(3)復(fù)方電解質(zhì)注射液：臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)復(fù)方電解質(zhì)注射液是一種接近于生理血漿的緩沖液，其中鈉離子140mmol、鉀離子5mmo/L、氯離子98mmo、pH74、滲透壓294 mOsmol，都與血漿(鈉離子142mmo/L、鉀離子42mmo、氯離子103mo/L、pH74、滲透壓3029m0smo)的生理濃度等同，避免高氯性代謝性酸中毒，具備強(qiáng)大的酸堿緩沖體系，使得溶液為生理性pH值，且能維持溶液的等張性。目前看，是一種較為理想的基礎(chǔ)溶媒。

2.添加劑通常凍存 UCMSC時(shí)，不加各種添加劑，但為了增加保護(hù)細(xì)胞活性的可靠性時(shí)，可以考慮在基礎(chǔ)溶媒基礎(chǔ)上增加能源物質(zhì)(如L-谷氨酰胺、腺苷)、抗氧化劑(N-乙酰半胱氨酸、亞硒酸鈉)生長(zhǎng)因子、抗凝劑(肝素鈣)等。

白蛋白不僅具有維持血漿膠體滲透壓和結(jié)合離子的能力，起到維持細(xì)胞外液的滲透壓平衡的作用；而且人血白蛋白本身所帶靜電荷為負(fù)電荷，能夠起到防止細(xì)胞集聚而處于分散狀態(tài)的功能，另外，人血白蛋白是臨床常用藥物，容易獲取且質(zhì)量可以得到保障，加入到干細(xì)胞制劑中使用相對(duì)安全。在制備臨床應(yīng)用級(jí)別的 UCMSC時(shí)，可以考慮加入白蛋白。

3.細(xì)胞保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑包括滲透性細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑(甘油、DMS0、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等)和非滲透性細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等)兩大類(lèi)。

(1)甘油又稱(chēng)為1,2,3-丙三醇，分子式CH2O3，分子量92.09，本品為無(wú)色、澄清的黏稠液體，與水或乙醇能任意混溶，常常作為溶劑和助懸劑和冷凍劑等使用，在凍存細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)甘油透過(guò)細(xì)胞膜的速度慢且會(huì)引起乳酸中毒，日前較少使用。

(2)DMSO又稱(chēng)為二甲基亞砜，分子式C2HOS，分子量78.13，本品為無(wú)色液體、無(wú)臭或幾乎無(wú)臭，與水、乙醇或乙醚能任意混溶，本品的凝點(diǎn)較低，為170-183℃，常用作溶劑和防凍劑等；DMSO相對(duì)甘油分子量小透過(guò)細(xì)胞膜的速度更快，能夠更好地保存細(xì)胞活性。DMSO本身具有一定的殺菌作用，通常可以直接使用，必要時(shí)只能采用過(guò)濾除菌法滅菌DMSO，切忌不能采用高壓滅菌法處理，因?yàn)楦邏簻缇鷷?huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，臍帶干細(xì)胞存儲(chǔ)導(dǎo)致冷凍保護(hù)效果降低。

二、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇

冷凍保存的 UCMSC從液氮中取出后，立即放入37℃的溫水中并迅速搖晃使其快速融化為細(xì)胞懸液。為防止凍存管爆裂傷人，應(yīng)該采取溫水箱加蓋或戴防護(hù)眼鏡等預(yù)防措施。UCMSC的復(fù)蘇應(yīng)在1~2分鐘內(nèi)快速解凍，防止細(xì)胞內(nèi)形成冰結(jié)和高濃度電解質(zhì)而對(duì)細(xì)胞造成損傷。DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞有一定毒性作用，解凍后的細(xì)胞懸液應(yīng)立即離心洗滌盡快去除DMSO。特別注意：冷凍保存 UCMSC的保護(hù)效果與冷凍速度、冷凍溫度和復(fù)蘇速度有密切關(guān)系，只有操作得當(dāng)，才能確保 UCMSC冷凍保存不會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。如果是臨床應(yīng)用級(jí)別的 UCMSC注射液，由于細(xì)胞凍存液和包裝都可以是直接臨床應(yīng)用,復(fù)蘇就比較簡(jiǎn)單。

凍存和復(fù)蘇是 UCMSC制備的zui后一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，“慢凍快融”是基本原則，程序降溫系統(tǒng)的使用可以有效實(shí)現(xiàn)緩慢降溫，溫控監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的使用可以確保長(zhǎng)期-196℃的恒定，只要特別注意細(xì)胞快速解凍復(fù)蘇即可確保細(xì)胞的凍存質(zhì)量。