制備 hUCMSC注射液，分離擴增和純化臍帶來源間充質干細胞是十分重要的一個關鍵環節，必須嚴格遵照以下程序和要求完成。除了嚴格遵守普通間充質干細胞分離擴增的基

本程序和要求之外，必須特別注意符合國家衛生部門制定的臨床生物制劑的特殊要求。

1.在經檢驗合格符合GMP生產條件且具備完整的干細胞制劑制備質量管理體系的細胞工程實驗室無菌條件下分離擴增臍帶間充質干細胞，造血干細胞存儲即取健康無傳染性病原微生物(zui低檢測標準至少應符合臨床輸血要求，HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV檢測為陰性)的潔凈臍帶一根，經注射用生理鹽水反復沖洗三遍以后，在無菌的培養皿中剝離雜質，將臍帶剪切為0.5cm長的若干段，再將每段臍帶在EP管內剪碎為1mm3以下的糊狀組織塊。

2.使用臨床應用級別的 DMEM/F12完全培養基懸浮糊狀組織塊，并將其轉移到經檢驗合格可用于臨床應用組織培養的T175細胞培養瓶中，加入10ml已調整好pH值的DMEMF12完全培養基，輕輕晃動培養瓶使組織塊均勻分散于培養瓶底部，在5%C02、37℃、飽和濕度的培養箱中靜置培養24小時。

3.適時在倒置顯微鏡下觀察并視情況3~4天換液1次,7~9天后可見大量細胞貼壁生長。此時，用吸管輕輕吸出一半培養液，輕輕搖晃培養瓶，使組織塊脫離瓶底，吸棄上清和懸浮組織塊并接種到新培養瓶中，造血干細胞存儲加入新鮮培養液繼續進行培養，適時觀察細胞并換液。至少反復進行3次重復貼壁培養，即可獲得常規培養3倍數量以上的原代 hUCMSO。

4.培養2周左右細胞可長到8%以上融合狀態，此時吸棄培養液并用生理鹽水漂洗后，加入適量臨床應用級別的0.25%的胰酶，充分混勻，觀察到細胞收縮有部分細胞脫落時立即終止反應，收集細胞懸液到離心管中,300~400g離心10分鐘，再加入生理鹽水適量離心漂洗，反復3次后，計數活細胞，用完全培養基稀釋，收集細胞進行傳代培養。

5.傳代培養通常采用專用細胞培養瓶，以 DMEM/F12培養基為基礎，按原代培養密度1:3的比例進行傳代培養。傳代培養至第3代，即可獲得相當數量的 hUCMSC。傳代培養的過程是純化間充質干細胞的過程。收集第三代以后的細胞用于鑒定，鑒定合格的hUCMSC用于制備 hUCMSC注射液。

6.長期在體外傳代培養的是否會衰老、突變等一直是人們關注的問題，也是影響細胞質量的深層次問題。國外對骨髓間充質干細胞體外長期培養研究發現：如果在體外連續傳代培養60次以后就會觀察到間充質干細胞衰老和自動向脂肪細胞分化。筆者長期培養實驗證明：造血干細胞存儲在體外傳代培養8次以內的臍帶間充質干細胞安全性和活性是有保證的。連續傳代8次以后，個別細胞會發生染色體變異。因此，筆者所在實驗室制備 hUCMSC注射液使用的細胞是第3~5代的 hUCMSC。